9. Наука на службе токсикологии. Спектральный анализ. Кристаллы и точки плавления. Структурный анализ рентгеном. Хроматография

9. Наука на службе токсикологии. Спектральный анализ. Кристаллы и точки плавления. Структурный анализ рентгеном. Хроматография

Тем временем события, происшедшие на процессе против Буханана, стали известны во всем мире. При всем неуважении к американской науке тех лет эти события послужили решающим толчком к усилиям разрешить окончательно вопрос определения алкалоидов и ликвидировать оставшиеся сомнения. В последние два десятилетия XIX века выяснилось, что большинство сообщений об ошибках, вызванных трупными алкалоидами, нужно отнести за счет нечисто проведенного анализа или поверхностного наблюдения за цветом реакции. К тому же исключается присутствие животных алкалоидов в экстрактах, полученных в результате точного применения метода Стаса. И, наконец, если это даже и случилось, то использование, по меньшей мере шести цветных реакций и в случае необходимости физиологической пробы, абсолютно исключает ошибки.

Важнее, однако, было то, что токсикология сделала уже первые шаги на пути к достижению своей цели в создании абсолютно безупречных методов определения алкалоидов, что приведет во второй четверти XX века к поразительным результатам.

20 октября 1910 года, в один из решающих дней процесса против доктора Криппена, свидетелем выступил доктор Уильям Генри Уилсокс, чтобы дать показания о яде, обнаруженном в останках Коры Криппен. Это имя мы уже встречали в разделе о судебной медицине. Речь шла о гиосцине, одном из трех растительных алкалоидов (атропин, гиосцин, гиосциамин), которые, будучи введенными в глаза кошки, вызывают очевидное расширение зрачков и при так называемом тесте Витали дают фиолетовый цвет. Занимаясь многие недели поисками таинственного яда в останках Коры Криппен, Уилсокс применил сначала давно испытанные реакции. Но, достигнув кульминационного пункта своих показаний, этот человек, которому суждено было в судебной токсикологии сыграть значительно большую роль, чем Стивенсону, стал говорить о вещах, которые по крайней мере в Лондоне были еще совершенно не известны. Он говорил о кристаллизации и о точках плавления алкалоидов.

Уилсокс не был таким «блестящим» свидетелем, как Спилсбери. В преклонные годы он говорил, иронизируя над самим собой, что его успехи перед судом нужно отнести за счет того, что он походил на простака, не будучи им. И теперь эти впервые появившиеся понятия он облек в такие невыразительные фразы, что трудно было оценить, какие перспективы эти открытия будут иметь в будущем.

После опыта с глазами кошки Уилсокс обработал полученные методом Стаса экстракты, содержащие алкалоиды, раствором бромистого калия. Большинство алкалоидов после этого давало осадки и образовывало кристаллы типичной для каждого алкалоида формы, что можно было наблюдать в микроскоп. Атропин и гиосциамин образовывали иглоподобные кристаллы, гиосцин же принимал форму капель.

Таким образом, Уилсоксу удавалось идентифицировать в своих экстрактах яд гиосцин.

Определение яда по кристаллам было первым шагом на новом пути. Правда, уже Стас пытался идентифицировать никотин с помощью кристаллизации и американец Вормлей сообщал о подобных опытах, но только теперь этот метод обратил на себя всеобщее внимание.

Но это не все. Впервые все интересующиеся этим вопросом узнали еще об одном новом методе. Он основан на том, что после кристаллизации при нагревании алкалоиды плавятся. Притом процесс плавления наступает у разных алкалоидов при совершенно разных температурах. Поэтому можно различать яды по точке их плавления.

Сравнительные микроскопы со вставками, на которых видны формы кристаллов, облегчали и ускоряли процесс сравнения и идентификации

Так во время перекрестного допроса Уилсокса защитником Криппена Тобином все узнали, что точка плавления обработанного хлоридом золота атропина — 148 °C, точка плавления гиосциамина — 160 °C и точка плавления гиосцина — 190 °C.

Работа последующих пяти десятилетий породила такие методы определения алкалоидов, о которых не могли мечтать не только первые изобретатели цветных реакций, но и преемники Уильяма Генри Уилсокса.

Их возникновение происходило на фоне развития химико-фармацевтической промышленности, начавшегося во второй четверти XX века с того, что путем выделения естественных растительных алкалоидов стали создавать искусственные синтетические продукты, которые походили по своему терапевтическому, а также ядовитому действию на соответствующие растительные алкалоиды или даже превосходили их.

В 1939 году фармакологи Айслеб и Шауманн открыли синтетическое вещество долантин, которое объединяло в себе свойства естественных алкалоидов атропина и морфия. Под названием «демерол», «петидин», «долозал», «меперидин», «пиридозал» совершил свое победное шествие вокруг света долантин, будучи медицинским средством, но в то же время средством случайных, добровольных или намеренных отравлений. Во время второй мировой войны химики Эргарт и Бокмюль обнаружили синтетический продукт поламидон, болеутоляющее действие которого во много раз превосходит морфий. Он также быстро нашел применение во всем мире, как амидон, адалон, долофин, физептон, миадон, гиптальгин, бутальгин, петальгин и др. Но долантин и поламидон — только два из многочисленных синтетических лечебных и ядовитых веществ, которые оказывают действие как алкалоиды и дают реакцию как алкалоиды.

К старым растительным ядам прибавилось множество синтетических алкалоидов. Число их продолжало расти, когда в 1937 году во Франции было выпущено первое искусственное лекарство антигистамин против аллергических заболеваний всех видов — от астмы до экземы. За несколько лет число их перевалило за две тысячи, среди них по крайней мере несколько дюжин являлось лечебными (и потенциально ядовитыми) веществами. Все это были искусственные алкалоиды.

Новые средства вынудили судебных токсикологов принять участие в соревновании между изготовлением ранее не известных ядов к выработкой методов их определения.

Метод Стаса не утратил своего значения. Он был лишь усовершенствован, но при этом требовалась большая чистота экстрактов. Требование это превысило степень, известную во времена Уилсокса. Не потеряли своего значения и цветные реакции. Их число возросло во много раз вместе с ростом числа ядов. В 1955 году имелось уже тридцать различных тестов определения морфия. В области разработки новых цветных реакций работали главным образом англичане, канадцы, американцы, немцы, французы, шведы и китайцы. Это были: Фултон, Томис, Шу Сингчен, Ц. Формило, К. Вэнтли и П. Беснард.

Идентификация алкалоидов по точке их плавления получила дальнейшее развитие в трудах ученых Австрии Фишера, Брандштеттера и Раймерса, а также в трудах профессора фармакологии в Инсбруке Людвига Кофлера, умершего в 1951 году. Кофлер изобрел специальный микроскоп, под которым можно было плавить исследуемые вещества, фиксировать начало плавления и сверять по термометру, вмонтированному в микроскоп, температуру плавления.

В это же время бурно развивался метод идентификации алкалоидов по их кристаллизации. Англичанин Е. Кларк создал в Лондоне коллекцию по меньшей мере пятисот форм кристаллов различных алкалоидов, чтобы сделать возможным быстрое сравнение кристаллов исследуемого объекта под микроскопом. Были испытаны почти двести химических реагентов, с помощью которых образуются кристаллы в растворах, содержащих алкалоиды. Пионерами этой работы были: В. Уитмор, И. Тревелл, П. Дюкенуаз, Л. Леви, Ф. Тенгер, А. Хавкинс, Г. Бахман, Г. Вагенаар, А. Марсико и Г. Ваксмут. Теперь достаточно было иметь несколько капель экстракта. Микрокапли в 0,05 миллилитра было достаточно, чтобы проделать пятьсот различных проб.

Больших успехов в области токсикологии удалось достичь к середине XX века благодаря физике. С тех пор как немецкие исследователи Роберт Бунзен и Густав Кирхгоф в 1859 году создали предпосылки применения спектрального анализа для нужд судебной медицины, прошло ровно сто лет. В 1895 году благодаря открытию рентгеновских лучей появился еще один вид лучей, также образующих спектры. В 1912 году немецкий физик, лауреат Нобелевской премии фон Лауэ указал на то, что кристаллы химических веществ могут служить призмами для преломления рентгеновских лучей. Если пропускать рентгеновские лучи через подобный кристалл, то он преломляет часть лучей таким специфическим образом, что по виду преломления можно судить о происхождении соответствующего кристалла. Английский ученый, лауреат Нобелевской премии У. Брэгг, голландский ученый, лауреат Нобелевской премии П. Добье, работавший в Цюрихе, в Берлине и позднее в США, а также его швейцарский коллега П. Шеррер разработали в годы, предшествовавшие первой мировой войне, и после 1914 года метод рентгеновского структурного анализа кристаллов. Позже подверглись регистрации особые свойства тысяч кристаллизированных химических веществ, отмеченных при рентгеновском структурном анализе. Но лишь в 1949, 1950, 1952 и 1955 годах токсикологи Л. Андерсон, Розенблюм, Марион, Гублей, Л. Леви и Г. Фармило распознали значение ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии для идентификации многих алкалоидов из экстрактов Стаса. В это время на чрезвычайное значение рентгеновского структурного анализа для токсикологии обратили внимание такие токсикологи, как датчанин Т. Гуанг и бельгиец Г. Лакруа. Этот анализ позволял просто и быстро определять кристаллы различных алкалоидов, а тем самым и сами алкалоиды. Американские ученые Варнс, Марвин, Габарино и Шепард возглавили работу по систематизации характерных признаков, способствуя идентификации с помощью рентгеновского спектрального анализа большого числа алкалоидов.

Но может быть, все это было не самым важным. Более важное открытие носит странно звучащее название «хроматография». Прежде всего англичанин А. Карри обеспечил этому методу анализа триумфальное шествие в токсикологию.

В 1903 году русский ботаник Цвет изучал водные растительные экстракты, которые содержали различные натуральные красящие вещества. Один из этих экстрактов он наливал в стеклянную трубку-колонку, наполненную порошком мела. При этом мел впитывал красящее вещество из экстракта. В головной части меловой колонки возникал слой, в котором оседали все красящие вещества, а с нижнего конца колонки стекал чистый водяной раствор растительного экстракта. Далее происходило неожиданное. Когда ученый сверху снова заливал воду в трубку-колонку, то цветная зона опускалась, но не целиком. Красящие вещества отделялись друг от друга и повисали на различной высоте колонки с четкими границами между цветами. Если снова наливали воду, то они опускались, стекая одно за другим.

Цвет открыл способ разделения смесей различных веществ и разложения их на составные части. Этот способ разделения получил название «хроматографический анализ», по названию краски (хрома) и письма (графия) на греческом языке. Способ этот был забыт и в начале 30-х годов вновь открыт немцем Рихардом Кюном в Гейдельберге. Выяснилось, что с помощью хроматографии можно разлагать на составные части различные химические вещества и таким образом идентифицировать их составные части. Если составные части были бесцветными, то их положение в колонке определялось с помощью ультрафиолетовых лучей или реактивов, которые, как и при токсикологических анализах, давали определенные цвета.

Хроматография

Наконец выяснилось, что мел можно заменить фильтровальной бумагой, которая давала тот же результат. С 1950 по 1960 год токсикологи овладевали новым методом. Бумажная хроматография стала для определения алкалоидов самым великим достижением со времен Стаса. В разработке этого метода принимали участие многие ученые: англичанин Карри, немцы Цандер и Зиммер, бразильцы Морес и Пальма, американец Генест, швейцарцы Бюхи, Шумахер и другие ученые. Созданные на протяжении столетия цветные реактивы стали средством, которое делает видимыми бесцветные алкалоиды, в мельчайших количествах оседающие раздельно на фильтровальной бумаге.

С введением хроматографического анализа в систему токсикологии закончилась столетняя история охоты за растительными алкалоидами и за их синтетическими родственниками. И все же это был лишь один акт из драмы человеческих усилий, заблуждений, триумфов, новых заблуждений и новых триумфов. Правда, речь идет об акте, определившем ход дальнейшего развития всей судебной токсикологии.

Борясь с алкалоидами, токсикология попутно научилась распознавать действие большого числа других ядов и определять их. Вместо когда-то известного небольшого ряда металлических и минеральных ядов эпоха химии и индустрии породила необозримое количество ядов и расширила круг их распространения. Их ряд протянулся от соединений марганца, железа, никеля и меди до таллия. В виде стиральных порошков, ядохимикатов для борьбы с насекомыми и медикаментов они попали в руки миллионов людей. Маленький ручеек газообразных ядов, как, например, газ синильной кислоты, также превратился в необозримый поток. Возглавлял ряд ядовитых газов по-прежнему углекислый газ. За ним следовали сероводородные и сероуглеродные соединения вплоть до трихлорэтилена. Все эти ядовитые вещества попадали в руки людей. То же самое относится к множеству кислот и щелочей, от метилсульфата до салициловой кислоты, компонента жаропонижающего и болеутоляющего аспирина, завоевавшей весь мир и уже много десятилетий занимающей третье место среди ядов самоубийц после углекислого газа и барбитуратов.

Ни один наблюдатель не мог бы оспаривать факта, что из первых усилий шедших на ощупь пионеров выросла целая наука. И все же, несмотря на все триумфы, все успехи, уже в XIX веке встал вопрос: достаточно ли доказать наличие яда в выделениях, в крови и в тканях тела живых или мертвых, чтобы установить, идет ли здесь речь о жертве умышленного отравления, самоубийства или о медицинском и профессиональном отравлении? Достаточно ли, как это иногда случалось, приблизительного определения количества обнаруженного яда и сделанных на этом основании приблизительных выводов о количестве принятого жертвой яда? Не следовало бы найти методы точного определения количества обнаруженных ядов? Не в этом ли заключается главная цель, венец всех усилий?